Anh Em Super Mario Hai người thợ sửa ống nước người Ý là Mario và Luigi đang sở hữu và vận hành công ty Super Mario Bros nhưng lại không thành công. Họ phải làm công việc kinh doanh hệ thống ống nước ở Brooklyn. Cha của họ không đồng ý với quyết định của Mario rằng anh sẽ từ bỏ công việc lương cao dưới tay tên Spike phản diện để bắt đầu kinh doanh.
Anh Em Super Mario - The Super Mario Bros. Movie xoay quanh cuộc phiêu lưu ở thế giới Vương quốc Nấm của anh em thợ sửa ống nước Mario và Luigi. Sau khi tình cờ bước tới vùng đất lạ từ một ống nước, Luigi đã bị chia tách với Mario và rơi vào tay quái vật rùa xấu xa Bowser, hắn đang âm mưu độc chiếm thế giới. Trong lúc cố gắng tìm kiếm người anh em của mình, Mario đã chạm mặt anh bạn nấm Toad và công chúa Peach. Từ đây họ sát cánh bên nhau trên hành trình ngăn chặn thế lực hắc ám.
